大鼠白介素 2 ELISA試劑盒技術(shù)資料

　　大鼠白介素 2 ELISA試劑盒技術(shù)資料

　　適用于大鼠血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本

　　介紹：

　　IL-2 主要由 T 細(xì)胞(特別是 CD4+T 細(xì)胞)有受抗原或絲裂原刺激后合成;B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞及單核-巨噬細(xì)胞亦能產(chǎn)生 IL-2, 成熟的大鼠 IL-2 與人和小鼠的 IL-2 分別具有 66%和 73%的氨基酸序列同一性,大鼠 IL-2 cDNA 序列含有 155 個(gè)氨基酸的前體糖蛋白，裂解 20 個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽產(chǎn)生成熟 IL-2,天然 IL-2 在 N 端含有糖基，但糖基對 IL-2 的生物學(xué)活性無明顯影響，等電點(diǎn)為 6.6～8.2;IL-2 具有抗腫瘤、抗微生物感染、引起移植排斥和自身免疫以及免疫調(diào)節(jié)等作用。

　　檢測原理：

　　BUNSEN本生 ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將

　　抗大鼠 IL-2 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上;分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的大鼠 IL-2 會(huì)與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合;洗板后加入生物素化抗大鼠IL-2 抗體，該抗體會(huì)與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的大鼠 IL-2 發(fā)生特異性結(jié)合;洗板后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會(huì)發(fā)生高強(qiáng)度的非共價(jià)結(jié)合;洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的大鼠 IL-2，則 HRP 會(huì)使無色 TMB 變成不同深淺(正相關(guān))的藍(lán)色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會(huì)變成黃色;最后，在 λmax=450nm(OD=450 nm)處測定反應(yīng)孔樣品吸光度(OD)，樣本中的

　　大鼠 IL-2 濃度與 OD 成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計(jì)算出樣本中大鼠IL-2 的濃度。

　　注意事項(xiàng)：

　　1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。

　　2. 試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請丟棄。

　　3. 試劑盒使用前請?jiān)谑覝鼗謴?fù) 30min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。

　　4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。

　　5. 為避免交叉污染，請?jiān)谠囼?yàn)中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜(※)及潔凈塑料容器。

　　6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運(yùn)輸過程中微量液體會(huì)沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理(5-10 S 即可)，使管壁上的液體集中在管底部，取用時(shí)，請用移液器小心吹打幾次。

　　7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分。

　　8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　安全提示：

　　試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時(shí)請帶上手套并注意防護(hù);在操

　　作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗;檢測血液樣本及其它體液樣本時(shí)，請按國家生物實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

　　試劑盒組成及儲(chǔ)存：

　　自備實(shí)驗(yàn)器材(不提供，可代購)

　　1. 酶標(biāo)儀(主波長 450nm，參考波長 630nm)

　　2. 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

　　3. 洗板機(jī)或洗瓶

　　4. 37℃孵育箱

　　5. 雙蒸水，去離子水，量筒等

　　6. 稀釋用聚丙烯試管

　　樣本收集及儲(chǔ)存：

　　1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：

　　將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存(24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲(chǔ)存)，避免反復(fù)凍融。

　　2. 血清樣本：

　　室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存(24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲(chǔ)存)，保存過程中如有沉淀，請?jiān)俅坞x心，避免反復(fù)凍融。

　　3. 血漿樣本：

　　將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小EP 管并于-20℃下保存(24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲(chǔ)存)，避免反復(fù)凍融。

　　※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果;如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的最高值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。

　　試劑準(zhǔn)備：

　　1. 試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入 37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。

　　2. 配制洗滌液：預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

　　3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液(SR1)1ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其溶解后輕輕混勻(濃度為4000pg/ml)，然后按照以下濃度：2000(用移液器吸取溶解好的標(biāo)準(zhǔn)品500ul加入稀釋液500ul)、 1000、 500、 250、125、62.5、31.25、 0 pg/ml進(jìn)行稀釋。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液(4000pg/ml)未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

　　4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量，用檢測稀釋液(SR2)將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液(稀釋前充分混勻)，請?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

　　5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液(SR3)將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液(稀釋前離心)，請?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。

　　6. 洗滌方法：

　　 自動(dòng)洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/

　　孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。

　　 手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液

　　300ul/孔，靜止 30 秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。

　　結(jié)果判斷：

　　1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。

　　2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值。

　　3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中IL-2含量可通過對應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

　　4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測，計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。

　　1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

　　本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大鼠 IL-2 的樣本含量

　　2. 靈敏度：

　　可檢測大鼠 IL-2 濃度達(dá) 7pg/ml，

　　20 個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算相應(yīng)的可檢測濃度。

　　3. 特異性：

　　不與大鼠 GDNF、 IFN-γ、 IL-1α、 IL-4、 β-NGF、 TNF-α 等反應(yīng)，人 IL-2、IL-2Ra、 IL-2Rβ等反應(yīng)。

　　4. 重復(fù)性：

　　板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%

　　5. 回收率：

　　在選取的健康大鼠血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個(gè)不同濃度水平的大鼠 IL-2，計(jì)算回收率。

　　6. 線性稀釋：

　　分別在選取的 4 份健康大鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度大鼠 IL-2，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評(píng)估線性。

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